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 無菌檢查陽性結果原因分析方法探討

藥品無菌檢查出現陽性結果的原因復雜,主要和實驗環境、實驗用品、操作人員無菌操作規范程度及供試品真實的無菌水平等有關,本文重點闡述與出現陽性結果有關的諸多實驗環境等因素,意在為微生物檢驗人員作陽性結果原因分析時提供參考。

一.相關因素

1.實驗用器皿等相關因素:

實驗用器皿、用具等因素可從包括藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量(無菌配制,非無菌配制)、培養器的無菌性能、培養基的無菌性等方面考慮。重點介紹藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量(無菌配制,非無菌配制)測試

2.實驗環境因素:

 無菌檢查過程中的空氣沉降菌、 工作臺面的染菌量、無菌工作服染菌量。

3.實驗人員因素:

操作人員雙手染菌量、不規范操作。

二.驗證方法

1.無菌檢查實驗用器皿等  

1.1首先應目視檢查供試品、無菌培養器包裝有否開裂、破損。發現包裝破損的不得使用;

1.2培養基包裝的塞子是否松動,有松動現象的應不得使用;

1.3藥品外包裝的消毒有效性

藥品外包裝上的染菌量不容忽視,必須經充分消毒后轉移到無菌操作臺面。

藥品外包裝上的染菌量驗證可采用下述方法進行:

(1)取供試品外包裝未經消毒直接置紫外燈下30分鐘后取樣。

(2)取供試品經酒精棉球或消毒液浸泡一定時間,擦干后再暴露在紫外燈下30分鐘后取樣。

供試液制備:

取供試品3個包裝,分別用無菌鑷子夾住經無菌氯化鈉溶液濕潤的無菌棉球,擦拭一周,棉球置100ml無菌氯化鈉溶液,另取一塊無菌棉球重復擦拭一遍,制成供試液。供試液振搖1分鐘經開放式濾膜法過濾、取濾膜培養、計數,得到的數據即可比較藥品外包裝2種消毒方法的消毒效果。

1.4酒精棉球等消毒劑的含菌量測試

酒精棉球等消毒劑的含菌量測試,可分別測試無菌配制及非無菌配制的消毒劑的含菌量,還需注意新鮮配制的與反復使用的消毒劑含菌量的變化。

測試方法可采用開放式濾膜法過濾、取濾膜培養、計數,得到的數據即可比較不同方法配制及不同時間使用的消毒劑的含菌量。

1.4.1無菌室常用消毒劑的配制:

無菌室使用的消毒劑應在凈化臺面上配制,需過濾的應準備已滅菌的濾器。配好的消毒劑應在盛放的瓶子上標明名稱、配制日期、失效期等。

1.4.1.1 75%酒精棉球:

取95%的酒精,加注射用水制成75%的酒精溶液,取該溶液用0.22μm微孔濾膜過濾后放入已滅菌的瓶中,備用。取經121℃30分鐘滅菌的脫脂棉球,置無菌包裝內,倒入75%的酒精溶液,即得。該酒精棉球在48h內使用。如取成品消毒酒精配制的,脫脂棉球需經121℃30分鐘滅菌。

1.4.1.2 0.1%新潔爾滅溶液的配制:

取注射用水,加入不同濃度的新潔爾滅溶液,使成0.1%濃度,并攪拌均勻,將配制好的溶液用0.22μm微孔濾膜過濾后放入已滅菌的瓶中,備用。此溶液應在48h內使用。

2實驗環境因素 無菌檢查過程中的空氣沉降菌測試、 工作臺面的染菌量測試、無菌工作服染菌量測試

2.1無菌實驗應選用10000級環境下置100級凈化臺或操作臺面的無菌室或無菌隔離器中進行。無菌室的潔凈度測試可參照潔凈室潔凈度檢查的方法進行并判定。

2.2無菌檢查過程中的無菌室環境監測,可采用空氣沉降菌測試來完成。

2.3工作臺面的染菌量測試

取樣時間,按正常的程序消毒,待實驗結束后取樣。

供試液制備:取5×5cm的滅菌標準規格板,放在凈化臺操作區表面,用浸有無菌氯化鈉溶液的棉拭子在規格板內來回涂抹,棉拭子剪去手握部位后放入100ml無菌氯化鈉溶液中制成供試液,以同法操作采樣2個表面。振搖供試液,備用。供試液經開放式濾膜法過濾、 取濾膜培養、計數,即可得到工作臺面的染菌量。

2.4無菌工作服染菌量測試

取樣時間  待操作人員實驗結束后用進行。

接觸碟制備  取無菌平皿,緩緩澆注事先融化(低于40℃)的營養瓊脂培養基至滿皿(使成凝固后瓊脂表面略高于平皿邊緣)凝固后備用。

測試方法:取備妥的平板2塊,待操作人員實驗結束后,分別在其工作服的雙臂靠近手腕處,輕輕印壓取樣。培養,計數。按企業制定的規定判定結果。

3.實驗人員因素 (操作人員雙手染菌量測試、不規范操作)。

3.1.1操作人員雙手染菌量測試

3.1.2取樣時間  實驗人員按常規程序洗手、消毒,于無菌檢查操作結束后進行。

3.1.3供試液制備  取浸有無菌氯化鈉溶液的棉拭子沿著操作人員雙手的指跟朝指尖方向拭抹,

3.1.4雙手分別拭抹食指到小指各4個指頭,棉拭子剪去手握部分,浸入100ml無菌氯化鈉溶液,

3.1.5振搖供試液并經開放式濾膜法過濾、 取濾膜培養、計數,即得操作人員雙手的染菌量。

3.1.6也可取備妥的營養瓊脂平板,待實驗結束后,操作人員將雙手的五個手指分別在瓊脂表面

涂抹。平板置35℃培養,計數,即得。

3.2不規范操作行為

在無菌室的硬件施設符合規定的情況下,要注意無菌操作不規范的行為,主要的有:

3.2.1超大量過濾供試液   有的單位將幾批藥品用一個濾器過濾(200瓶-400瓶),超大量過濾供試液造成的頻繁換瓶,會導致抽入大量空氣,引發供試液假陽性結果。就是在正常檢查過程中,也要求關機換瓶,以防止抽入大量空氣,引發供試液假陽性結果。

3.2.2違反操作規程,在供試品未溶解徹底的情況下過濾,造成堵膜使培養器杯內壓力增加,培養器護帽反復彈出,破壞空氣濾膜的完整性。

3.2.3抽濾過程中泵速過快  特別在抽濾安瓶裝供試液時,集菌儀的泵速不能超過50轉,不然過快的泵速也會導致抽入大量空氣,導致供試品的假陽性結果。

3.2.4消毒劑的配制與使用管理不規范引起的供試品假陽性的案例并不少見。

3.2.5要重視藥品外包裝的消毒有效性,因藥品外包裝上污染的微生物可直接被引入到操作過程。

3.2.6培養基多劑量包裝,實驗過程中反復抽取很有可能造成污染。

3.2.7要注意無菌衣的潔凈度,無菌衣在實施無菌操作前一定要經過滅菌處理。

三.供試品出現陽性結果后的原因追溯方法

樣品無菌檢查出現陽性結果時,如操作的回顧性追溯及培養器、培養基的陰性對照、實驗環境的沉降菌等常規生物監控均無發現原因的,應進行污染菌的溯源調查。過程大致如下:

1.陽性菌種分離、鑒定。

2。相關因素排查

2.1實驗操作環境空氣污染微生物

方法:浮懸菌采樣器采取無菌室空氣—空氣樣本中平板菌落形態與檢出陽性菌比較—取形態接近的純化—鏡檢—菌體形態與陽性菌比較---一致的繼續按陽性菌的鑒別程序鑒定----結果判定。

2.2消毒液微生物污染

消毒液污染的微生物溯源比較復雜,污染微生物的來源有消毒劑本地帶入、使用者雙手、配制用水、盛放容器等,一一排查的可操作性不強,下面僅介紹與檢出陽性菌相關的消毒液排查的方法

方法:

2.2.1菌種分離:陽性檢出發現時原消毒液尚保留的,可取消毒液100ml,用開放式過濾器過濾后,生理鹽水沖洗300ml,取下濾膜,貼在相應的培養基平板上,(視檢出的陽性菌性質選用培養基),厭氧或需氧培養。有菌落生長的,平板菌落形態與撿品陽性菌比較—取形態接近的純化—鏡檢—菌體形態與陽性菌比較---一致的繼續按陽性菌的鑒別程序鑒定----結果判定。

2.2.2陽性檢出發現時原消毒液已廢棄,可取一定量的陽性菌接種到無菌方法配制的原消毒液中,放置過夜,取一定量,經開放式過濾器過濾后,用生理鹽水沖洗300ml,取下濾膜,貼在相應的培養基平板上,計數回收微生物。如接種的微生物能回收到75%,那么撿品陽性菌的污染源來自消毒液的可能性較大。

2.3生產環境排查

2.3.1到生產現場采集空氣微生物,取菌落形態接近的純化—鏡檢—菌體形態與陽性菌比較---一致的繼續按陽性菌的鑒別程序鑒定----結果判定。

2.3.2陽性檢出菌種與以往生產環境中收集的微生物比較,判斷。(企業必須自建菌種庫)

 

 

 

 

 

實驗室供稿

2010.2.9

 微生物限度培養器使用中可能出現的誤區分析

1、誤區一  微生物限度培養器過濾完成后,在轉動取杯器的過程中發生膜破現象。
    1)原因分析:整個微生物限度系統屬負壓過濾,過濾完成后管路內存在一定的負壓,若轉動取杯器時速度過快,負壓未得到完全釋放,就可能發生膜破現象。
    2)操作建議:過濾完成轉動取杯器時,會聽到卸壓聲音,將取杯器旋轉至培養器下端處即暫停轉動取杯器,待卸壓完成后(卸壓過程約需3~4S),再繼續轉動取杯器將培養器向上頂起,待取杯器旋轉至最上端時即可安全取杯。

2、誤區二 使用微生物限度培養器檢驗純化水等樣品,經培養后濾膜表面無菌落生長即認為是培養器本身靈敏度不夠。
    在使用微生物限度培養器檢驗純化水、注射用水的過程中,在濾膜表面無菌落生長或生長不明顯,原因可能是使用時將1ml純化水直接加入濾杯中直接過濾,供試液未經過稀釋,菌落可能集中在一起;而且由于純化水,注射用水本身經過凈化處理,含菌量很少,檢驗結果菌落數很少或無菌落生長都是有可能的,同時要注意藥典對檢驗量的要求,如注射用水的檢驗量應為200ml,可能很容易忽略。
    建議在微生物限度檢查中,向培養器中加入供試液的體積較少時,一定要經過適當的稀釋,使供試液中含有的微生物能夠充分的分散;尤其是在檢驗純化水等供試品時,務必達到規定的檢驗量,在含菌量較少的情況下倘若檢驗量達不到規定要求的話,就更難得到準確的菌落計數結果。

 集菌儀一般故障檢修

1.顯示屏無顯示:檢查電源情況,插座、儀器保險絲等
2.馬達運行不平穩: 檢查電源電壓是否太低(電壓低于200V時儀器將出現間歇性運轉)
3.泵頭轉輪不轉:先停止轉輪, 取下泵蓋板,轉動轉輪,使定緊螺釘外露,擰緊固定螺絲即可。
4.轉輪與泵頭相擦: 檢查轉輪上下位置偏向,松開轉輪固定螺絲。適當調整轉輪位置,然后擰緊固定螺絲
5.儀器空載能運轉,負載不能運轉時,檢查滾輪上的三個滾筒是否卡住,如不能轉動,可調換整個滾輪。

如無法解決,請咨詢生產廠家或由廠家幫助解決。

 
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